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重组抗菌肽的特性:溶解性,抗菌性,影响抗菌肽活性的因素

1 介绍

菌丝霉素,是从腐生真菌上首先分离到的类似防御素的多肽。包括一个α-β主体结构,由一个α螺旋和两个反向β股组成,通过3对二硫键来稳定结构(Cys4–Cys30, Cys15–

Cys37 ,Cys19–Cys39) 。它对肺炎链球菌有强烈的机制作用,包括那些对传统抗生素有耐药性的菌株,而且在生理离子浓度下也具有杀菌作用。对由肺炎链球菌引起的胸膜炎和肺炎的实验小鼠用菌丝霉素进行治疗,其效果与万古霉素和青霉素相当。菌丝霉素对A549细胞,正常人类支气管上皮细胞,肺成纤维细胞没有毒性,不引起转录,能刺激A549细胞产生IL-8因子,所以其被认为是相对安全的。这些结果表明,真菌菌丝霉素作为临床上潜在的抗生素替代品将会做进一步的研究和关注。

菌丝霉素在中性PH条件下溶解性很差,有报道表明,像葡萄糖,精氨酸,EDTA,二甲基亚砜等小分子能有效的抑制其聚集,从而便于蛋白质的正确折叠。我们猜测这些小分子可能是影响菌丝霉素的溶解度。防御素中二硫键被保留下来,一般认为对这一类型的多肽,二硫键在维持结果稳定和生物功能上起着重要的作用。然而,在菌丝霉素中二硫键的作用并没有完全弄明白。

体外实验表明,多数防御素的抗菌能力收到阳离子的影响,特别在生理盐水存在的条件下进行评估。菌丝霉素在生理离子强度下表现出杀菌效果。但是阳离子对菌丝霉素对金黄色葡萄球菌的杀菌活性的确切的影响没有见到相关报道。

我们通过大肠杆菌表达系统得到了重组的菌丝霉素,同时研究了小分子对抗菌肽溶解性的影响。我们对重组菌丝霉素的抗菌谱和溶血活性都做了描述,并对二硫桥和离子对抗菌肽的抗菌活性影响做了研究。

2材料与方法2.1菌株和质粒

E. coli DH5用来繁殖pET-32a(+)和pETplectasin 质粒, E. coli BL21(DE3)作为表达载体,抗菌活性检测的目标菌株是

对全部高中资料试卷电气设备,在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验;通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关,系电,力通根保护据过生管高产线中工敷资艺设料高技试中术卷资料配不置仅试技可卷术以要是解求指决,机吊对组顶电在层气进配设行置备继不进电规行保范空护高载高中与中资带资料负料试荷试卷下卷问高总题中体配资料,置而试时且卷,可调需保控要障试在各验最类;大管对限路设度习备内题进来到行确位调保。整机在使组管其高路在中敷正资设常料过工试程况卷中下安,与全要过,加度并强工且看作尽护下可关都能于可地管以缩路正小高常故中工障资作高料;中试对资卷于料连继试接电卷管保破口护坏处进范理行围高整,中核或资对者料定对试值某卷,些弯审异扁核常度与高固校中定对资盒图料位纸试置,卷工编保写护况复层进杂防行设腐自备跨动与接处装地理置线,高弯尤中曲其资半要料径避试标免卷高错调等误试,高方要中案求资,技料编术试写交、卷重底电保要。气护设管设装备线备置动高敷、调中设电试作资技气高,料术课中并且试、中件资卷管包中料拒试路含调试绝验敷线试卷动方设槽技作案技、术,以术管来及架避系等免统多不启项必动方要方式高案,中;为资对解料整决试套高卷启中突动语然过文停程电机中气。高课因中件此资中,料管电试壁力卷薄高电、中气接资设口料备不试进严卷行等保调问护试题装工,置作合调并理试且利技进用术行管,过线要关敷求运设电行技力高术保中。护资线装料缆置试敷做卷设到技原准术则确指:灵导在活。分。对线对于盒于调处差试,动过当保程不护中同装高电置中压高资回中料路资试交料卷叉试技时卷术,调问应试题采技,用术作金是为属指调隔发试板电人进机员行一,隔变需开压要处器在理组事;在前同发掌一生握线内图槽部纸内故资,障料强时、电,设回需备路要制须进造同行厂时外家切部出断电具习源高题高中电中资源资料,料试线试卷缆卷试敷切验设除报完从告毕而与,采相要用关进高技行中术检资资查料料和试,检卷并测主且处要了理保解。护现场装置设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况,然后根据规范与规程规定,制定设备调试高中资料试卷方案。摘要:

菌丝霉素是第一个被发现的真菌防御素,具有强的抗革兰氏阳性菌活性。为了评估菌丝霉素所潜在的治疗应用价值,本文通过生产菌丝霉素,并对其溶解性,抗菌活性及影响抗菌活性的因素进行研究。我们通过融合蛋白表达和柱上酶切,在大肠杆菌中得到高产量重组的菌丝霉素。在10%甘油的醋酸缓冲液中,加入0.5M精氨酸能显著增加菌丝霉素的溶解性,使菌丝霉素的溶解度从89ug/ml上升到408ug/ml。菌丝霉素在Tris-甘油-EDTA缓冲液的溶解度为846ug/ml。菌丝霉素具有抗革兰氏阳性菌肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌活性,其最小抑菌浓度分别为2ug/ml和0.5ug/ml。对革兰氏阴性菌和真菌没有抗菌活性或很低的抗菌活性。菌丝霉素(128ug/ml)对兔子红细胞没有表现出溶血活性。减少二硫酥糖醇的浓度,菌丝霉素对金黄色葡萄球菌的抗菌活性会降低,表明二硫键对于抗菌肽最大活性是必须的。菌丝霉素通过生理作用和二价阳离子作用起到杀菌作用。抗菌活性会有微弱的减低在一定浓度依赖的二价阳离子下,然而,Ca离子浓度超过25mM,抑菌活性完全丧失。这些结果表明,二硫键的存在和二价阳离子的缺乏在菌丝霉素抗菌活性上扮演这一个很重要的角色。

关键词:重组 菌丝霉素 溶解度 抗菌活性 二硫键 阳离子

E. coli CVCC 195(K88), Pseudomonas aeruginosa CVCC 2087,

S. aureus ATCC 25923 and S. pneumoniae CVCC 2350 均购于中国兽医药品监察所,2.2重组表达和菌丝霉素纯化

成熟的菌丝霉素基因是根据大肠杆菌优势密码子通过反转录合成。由sangon生物科技公司(中国上海)合成的包含一个BamHI识别位点,一个蛋白酶因子Xa切割位点,成熟的菌丝霉素编码基因,终止密码子,Xhol位点的DNA序列。经过BamHI,Xhol消化后,将DNA序列连接到pET-32a(+)上,构建重组的PET菌丝霉素质粒载体,将PET菌丝霉素质粒转化到大肠杆菌DH5α内,然后在添加100ug/ml的氨苄青霉素LB琼脂平板上培养,通过DNA序列来鉴定质粒的正确链接和转化。

在37℃下,将重组E.coli BL21(DE3)培养在含有100ug/ml的TB培养基里,至OD600为1.0。然后通过添加0.4mM IPTG诱导菌丝霉素基因表达。在30℃下,诱导表达的时间分别为0h,1h,2h,4h,6h,16h。通过梯度离心(12,000 rpm, 5 min and 4 ?C),收集上清液,通过12%SDS-PAGE进行分析。

1个湿重细胞经过5ml结合缓冲液(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,10mM 咪唑,pH8.0)进行悬挂和细胞膜片段化处理(150W,6×5min of a 30% 工作周期)。细胞碎片通过梯度离心(12000rpm,20min,4℃)进行去除,上清液通过过His标签的Ni柱层析,用4柱体积的结合缓冲液进行平衡。用结合缓冲液洗便于后续基线吸收,融合蛋白的洗脱过程中4柱体积洗脱缓冲液的速率为1ml/min,分别用四种浓度

20,50,80,200,300,500mM咪唑进行洗脱。洗脱的产物用12%的SDS-PAGE进行检测。使用一种数量软件对蛋白质条带进行数量分析。

2.3 硫氧还-菌丝霉素融合蛋白柱上切割和菌丝霉素的纯化

重组细胞裂解后获得上层碎片被装载到已经平衡了的Ni-NTA树脂,用4柱体积的含有20mM咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱。然后用Xa因子的缓冲液进行平衡,切割反应是在包含有20U Xa因子/ml柱体积的切割缓冲液中进行,温度为21℃,时间分别为

0,6,12,24,48,96h。目的肽和His标签融合蛋白相继用4柱体积的和包含有200mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱即可。通过0,6,12,24,48,96h切割分离得到相应的产物,并通过麦黄酮SDS-PAGE进行了检测。目的肽在中国科学院生物物理研究所蛋白质组学实验室通过飞行时间解吸质谱检测。

2.4小分子对菌丝霉素溶解度的影响

将菌丝霉素装入1000Da截留分子量的透析管中置于去离子水中透析,然后冻干,储存在-20℃用于活性测定。有四种小分子物质(10% glycerol, 0.5M L-Arg, 20% DMSO and 10mM DTT)被观察到其对菌丝霉素在两种溶液中溶解度有影响.除盐的菌丝霉素溶解在1mg/ml的0.01%HAc缓冲液中和TGE缓冲液(50mM Tris, 0.5mM EDTA, 50mM NaCl, 10% glycerol, pH 7.9),同时含有1-3的四种测试物质。然后,在室温下,摇床孵化24h。梯度离心收集上清液(15000×g, 10min),然后用不含β-巯基乙醇的麦黄酮SDS-PAGE。使用一种数量软件对蛋白质条带进行数量分析(Version 4.6.2, Bio-Rad, USA)。

2.5抗菌活性和溶血活性的检测

柱切割后获得目的肽片段,过superdex柱进一步纯化,用0.015M NH4HCO3(pH 4.7)流速为0.5ml/min进行洗脱。活性片段进行冻干。用肉汤培养基对最小抑菌浓度进行检测。被测试微生物是处于对数生长期的培养在肉汤培养基中革兰氏阳性细菌,LB培养基中的革兰

对全部高中资料试卷电气设备,在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验;通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关,系电,力通根保护据过生管高产线中工敷资艺设料高技试中术卷资料配不置仅试技可卷术以要是解求指决,机吊对组顶电在层气进配设行置备继不进电规行保范空护高载高中与中资带资料负料试荷试卷下卷问高总题中体配资料,置而试时且卷,可调需保控要障试在各验最类;大管对限路设度习备内题进来到行确位调保。整机在使组管其高路在中敷正资设常料过工试程况卷中下安,与全要过,加度并强工且看作尽护下可关都能于可地管以缩路正小高常故中工障资作高料;中试对资卷于料连继试接电卷管保破口护坏处进范理行围高整,中核或资对者料定对试值某卷,些弯审异扁核常度与高固校中定对资盒图料位纸试置,卷工编保写护况复层进杂防行设腐自备跨动与接处装地理置线,高弯尤中曲其资半要料径避试标免卷高错调等误试,高方要中案求资,技料编术试写交、卷重底电保要。气护设管设装备线备置动高敷、调中设电试作资技气高,料术课中并且试、中件资卷管包中料拒试路含调试绝验敷线试卷动方设槽技作案技、术,以术管来及架避系等免统多不启项必动方要方式高案,中;为资对解料整决试套高卷启中突动语然过文停程电机中气。高课因中件此资中,料管电试壁力卷薄高电、中气接资设口料备不试进严卷行等保调问护试题装工,置作合调并理试且利技进用术行管,过线要关敷求运设电行技力高术保中。护资线装料缆置试敷做卷设到技原准术则确指:灵导在活。分。对线对于盒于调处差试,动过当保程不护中同装高电置中压高资回中料路资试交料卷叉试技时卷术,调问应试题采技,用术作金是为属指调隔发试板电人进机员行一,隔变需开压要处器在理组事;在前同发掌一生握线内图槽部纸内故资,障料强时、电,设回需备路要制须进造同行厂时外家切部出断电具习源高题高中电中资源资料,料试线试卷缆卷试敷切验设除报完从告毕而与,采相要用关进高技行中术检资资查料料和试,检卷并测主且处要了理保解。护现场装置设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况,然后根据规范与规程规定,制定设备调试高中资料试卷方案。氏阴性细菌,和TPD中酵母菌。均稀释到1×105CFU/ml,使用相同的培养基。MH肉汤培养基中增添5%去纤维蛋白的羊血用于肺炎链球菌的培养。每小分100ul细胞溶液(1-5×105CFU/ml)和两倍的肽稀释液进行温育孵化,在35℃下,大肠杆菌和铜绿假单胞杆菌孵化16-20h,金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌孵化24h,在28℃下,白色念珠菌孵化24h。对微生物100%抑制的所需要抗菌肽浓度被认定为最小抑菌浓度。每个实验重复三次。

菌丝霉素溶血活性是通过以前所发表的方法来测定。每份中分别

0.625,1.25,2.5,5,10,20,40,80,160,320,640,1280ug/ml 的菌丝霉素10ul和90ul的2.5%家兔红细胞无菌磷酸缓冲液。37℃下孵化30min,样品于10000×g离心3min,取上清液,置于540nm下测吸光度。溶血程度归因于1% Triton X-100 ,磷酸缓冲液被用来做对照。

2.6菌丝霉素的氧化还原性检测

在10mM DTT溶液中,37℃下温育14和20h,纯的菌丝霉素会被还原。在20% DMSO溶液中,室温放置24h,菌丝霉素会被氧化。菌丝霉素还原和氧化均是通过不含有β-巯基乙醇的麦黄酮SDS-PAGE和抑制作用区域法进行检测。

2.7一价和二价阳离子对菌丝霉素抗-金黄色葡萄球菌活性的影响

要确定阳离子对菌丝霉素对金黄色葡萄球菌的抗性的影响,将以下样品,16ug/ml 的菌丝霉素,1×105CFU/ml金黄色葡萄球菌,4种梯度阳离子溶液(0–300mM NaCl or KCl and 0–50mM CaCl2 or MgCl2)加入含有1mM磷酸缓冲液(pH7.4)的100ul体积,37℃孵化3h,然后,在37℃下至肉汤培养基培养24h。细菌被杀死的比例通过595nm下测定吸光度值来确定。

对全部高中资料试卷电气设备,在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验;通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关,系电,力通根保护据过生管高产线中工敷资艺设料高技试中术卷资料配不置仅试技可卷术以要是解求指决,机吊对组顶电在层气进配设行置备继不进电规行保范空护高载高中与中资带资料负料试荷试卷下卷问高总题中体配资料,置而试时且卷,可调需保控要障试在各验最类;大管对限路设度习备内题进来到行确位调保。整机在使组管其高路在中敷正资设常料过工试程况卷中下安,与全要过,加度并强工且看作尽护下可关都能于可地管以缩路正小高常故中工障资作高料;中试对资卷于料连继试接电卷管保破口护坏处进范理行围高整,中核或资对者料定对试值某卷,些弯审异扁核常度与高固校中定对资盒图料位纸试置,卷工编保写护况复层进杂防行设腐自备跨动与接处装地理置线,高弯尤中曲其资半要料径避试标免卷高错调等误试,高方要中案求资,技料编术试写交、卷重底电保要。气护设管设装备线备置动高敷、调中设电试作资技气高,料术课中并且试、中件资卷管包中料拒试路含调试绝验敷线试卷动方设槽技作案技、术,以术管来及架避系等免统多不启项必动方要方式高案,中;为资对解料整决试套高卷启中突动语然过文停程电机中气。高课因中件此资中,料管电试壁力卷薄高电、中气接资设口料备不试进严卷行等保调问护试题装工,置作合调并理试且利技进用术行管,过线要关敷求运设电行技力高术保中。护资线装料缆置试敷做卷设到技原准术则确指:灵导在活。分。对线对于盒于调处差试,动过当保程不护中同装高电置中压高资回中料路资试交料卷叉试技时卷术,调问应试题采技,用术作金是为属指调隔发试板电人进机员行一,隔变需开压要处器在理组事;在前同发掌一生握线内图槽部纸内故资,障料强时、电,设回需备路要制须进造同行厂时外家切部出断电具习源高题高中电中资源资料,料试线试卷缆卷试敷切验设除报完从告毕而与,采相要用关进高技行中术检资资查料料和试,检卷并测主且处要了理保解。护现场装置设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况,然后根据规范与规程规定,制定设备调试高中资料试卷方案。Fig.1 最佳密码子核苷酸序列和相应的重组菌丝霉素氨基酸序列。氨基酸序列用单个大写字母表示,其写在对应密码子的第二个核苷酸下面。XhoI和BamHI的限制位点和Xa因子的切割位点用箭头标示。画线部分为成熟菌丝霉素的氨基酸序列。星号标识的是终止密码子。

3结果

3.1 硫氧还菌丝霉素融合蛋白的表达和纯化

硫氧还菌丝霉素融合蛋白条带出现在23kDa附近,而理论相对分子质量为22566.4Da(Fig.2A)。经过4h诱导期后,融合蛋白最大产量达到了总蛋白的

53.5%(Fig.2A),58.5%是以融合蛋白的形式存在(Fig.2B)。通过过His标签Ni2+-NTA柱从细菌细胞裂解液中分离纯化融合蛋白部分,洗脱液用80mM咪唑,每升含硫氧还菌丝霉素融合蛋白培养液得到纯度为94.9%的产量达到95.1mg。

Fig2. 重组的硫氧还菌丝霉素融合蛋白在大肠杆菌中的表达。(A)在大肠菌BL21(DE3)中表达的融合蛋白跑的SDS-PAGE。Lane1:大肠杆菌BL21(DE3)的总蛋白; Lanes 2 and 3:含有PET-32a(+)的大肠杆菌BL21(DE3)经过IPTG诱导0h和4h的总蛋白;Lane4-9:经IPTG诱导

0,1,2,4,6,16h表达后从大肠杆菌BL21(DE3)中提取的总蛋白量。(B)硫氧还菌丝霉素融合蛋白的不可溶部分,可容部分,和总细胞裂解液的SDS-PAGE (C)SDS-PAGE纯化硫氧还菌丝霉素融合蛋白。Lane1 和2:可溶和不可溶蛋白片段;Lane3:可渗透的顶端 Lanes4-9:从组氨酸标签Ni柱上洗脱纯化硫氧还菌丝霉素融合蛋白 ,缓冲液中咪唑浓度分别为20,50,80,200,300,500mM。Lane M:标准蛋白相对分子质量

3.2硫氧还菌丝霉素融合蛋白的Xa因子柱上切割

Xa因子能切割四肽序列Ile-Glu-Gly-Arg,被用来除去纯化的硫氧还菌丝霉素融合蛋白中的硫氧还蛋白标签。为增加切割效率和重组多肽产量,柱上切割被作为制备菌丝霉素。经过第一次12h切割后,硫氧还菌丝霉素融合蛋白的量由90.5%降至74%,然后,经过96h切割后,降至51%,带有硫氧还蛋白的量和切割的菌丝霉素增加量相一致(Fig.3A)。经过12h柱上Xa因子切割后,在麦黄酮SDS-PAGE目标分子量处观察到目的条带(Fig.B),用飞行时间基质解吸质谱仪分析得到一个主要的峰,显示目的多肽片段的相对分子质量为4399.12-4407.12(Fig.3C)。这些结果表明重组菌丝霉素是一种混合存在形式,有三对二硫键的氧化态形式(相对分子质量为4401.9Da),有一个或两个二硫键的中间态,和完全不含二硫键的状态(相对分子质量为4407.9Da).从1L培养物中获取了重组菌丝霉素约1.75mg。

3.3小分子物质对菌丝霉素溶解度的影响

菌丝霉素在0.01%的HAc缓冲液中的溶解度很低,仅为89ug/ml(Fig.4.Lane 1). 加10%的葡萄糖后,溶解度没有提高(Fig.4,Lane2)。向含有10%葡萄糖的HAc缓冲液中加入0.5M精氨酸,菌丝霉素的溶解度由89ug/ml增加到408ug/ml,导致其溶解度上升的原因是菌丝霉素由非折叠状态和中间态转变为天然状态。DMSO的添加对菌丝霉素溶解度没有影响(Fig.4,Lane3).溶解度最高的是加入TGE缓冲液,其溶解度可达到

846ug/ml(Fig.4,Lane 6),其是9.5倍于HAc缓冲液中的溶解度。在TGE缓冲液中,甘油具有稳定菌丝霉素,防治菌丝霉素聚集,EDTA能防治Cys被氧化,正于文献所述。然而,在TGE缓冲液中加入Arg或者Arg+DMSO溶液时,菌丝霉素的溶解度降为52%-53%(Fig.4,Lanes7 and 8)。当DTT中加入HAc和TGE缓冲液后,因为溶解度降低,而菌

对全部高中资料试卷电气设备,在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验;通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关,系电,力通根保护据过生管高产线中工敷资艺设料高技试中术卷资料配不置仅试技可卷术以要是解求指决,机吊对组顶电在层气进配设行置备继不进电规行保范空护高载高中与中资带资料负料试荷试卷下卷问高总题中体配资料,置而试时且卷,可调需保控要障试在各验最类;大管对限路设度习备内题进来到行确位调保。整机在使组管其高路在中敷正资设常料过工试程况卷中下安,与全要过,加度并强工且看作尽护下可关都能于可地管以缩路正小高常故中工障资作高料;中试对资卷于料连继试接电卷管保破口护坏处进范理行围高整,中核或资对者料定对试值某卷,些弯审异扁核常度与高固校中定对资盒图料位纸试置,卷工编保写护况复层进杂防行设腐自备跨动与接处装地理置线,高弯尤中曲其资半要料径避试标免卷高错调等误试,高方要中案求资,技料编术试写交、卷重底电保要。气护设管设装备线备置动高敷、调中设电试作资技气高,料术课中并且试、中件资卷管包中料拒试路含调试绝验敷线试卷动方设槽技作案技、术,以术管来及架避系等免统多不启项必动方要方式高案,中;为资对解料整决试套高卷启中突动语然过文停程电机中气。高课因中件此资中,料管电试壁力卷薄高电、中气接资设口料备不试进严卷行等保调问护试题装工,置作合调并理试且利技进用术行管,过线要关敷求运设电行技力高术保中。护资线装料缆置试敷做卷设到技原准术则确指:灵导在活。分。对线对于盒于调处差试,动过当保程不护中同装高电置中压高资回中料路资试交料卷叉试技时卷术,调问应试题采技,用术作金是为属指调隔发试板电人进机员行一,隔变需开压要处器在理组事;在前同发掌一生握线内图槽部纸内故资,障料强时、电,设回需备路要制须进造同行厂时外家切部出断电具习源高题高中电中资源资料,料试线试卷缆卷试敷切验设除报完从告毕而与,采相要用关进高技行中术检资资查料料和试,检卷并测主且处要了理保解。护现场装置设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况,然后根据规范与规程规定,制定设备调试高中资料试卷方案。丝霉素电泳条带消失。

3.4抗菌性和溶血活性检测

重组菌丝霉素对革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,真菌的抗菌活性均被确定。如表一所示,菌丝霉素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度是青霉素和万古霉素的两倍,对肺炎链球菌的最小抑菌浓度与万古霉素相当,八倍的低于青霉素。很明显,菌丝霉素对肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用。菌丝霉素同时还对大肠杆菌E. coli CVCC 195(K88)和铜绿假单胞菌CVCC 2087有抗性,浓度达到128ug/ml。但是,白色念珠菌对重组菌丝霉素具有具有耐药性。菌丝霉素浓度达到128ug/ml时都不会引起兔红细胞溶血,而这个浓度会杀死革兰氏阴性细菌。这一结果表明,菌丝霉素没有破坏真核生物细胞膜的完整性。

3.5氧化还原反应对菌丝霉素抗金黄色葡萄球菌活性的影响

通过被DMSO氧化或者DTT还原的溶解状态的菌丝霉素的研究,来决定菌丝霉素二硫键的功能。氧化态的抑菌圈直径(d Fig.5A)和还原态的抑菌圈直径(f Fig.5A)分别为23和9.5mm。这些结果表明,对菌丝霉素表现出最大抗菌活性而言,β折叠三级结构中二硫键是必须的。凝胶分析表明,菌丝霉素经DTT处理1h后的还原态形式比氧化态形式走的更快。(Fig.5B,Lanes4 和5)。高分子量的条带表明可能是还原态菌丝霉素聚集原因。

3.6一价和二价阳离子对菌丝霉素抗-金黄色葡萄球菌活性的影响

单价阳离子对菌丝霉素抗金黄色葡萄球菌活性没有影响。当Na+或者K+浓度达到

150mM时,对菌丝霉素活性几乎没什么影响,几乎保持100%活性,就算Na+或K+离子浓度达到300mM时,菌丝霉素活性依然保留97.7%。(Fig.6A)

二价阳离子对菌丝霉素抗金黄色葡萄球菌的活性依赖于二价阳离子的浓度。在Mg2+和Ca2+在生理浓度以下,观察到其对菌丝霉素活性的影响是有限的,当浓度达到1.56mM时,菌丝霉素抗经黄色葡萄球菌的活性被100%和92.4%的抑制(Fig.6B).随着二价阳离子浓度的增加,菌丝霉素的活性下降的越显著(Fig.6B).Ca2+对抗金黄色葡萄球菌活性的影响比Mg2+更敏感。Ca2+浓度达到6.25mM和12.5mM时,菌丝霉素分别能杀死64%和7.4%的金黄色葡萄球菌,然而,在相同浓度的Mg2+下,分别能杀死100%和90%的金黄色葡萄球菌(Fig.6B).这些结果表明,二价阳离子,特别是Ca2+,相对于单价阳离子,在菌丝霉素抗菌活性上扮演着一个更重要的角色。

对全部高中资料试卷电气设备,在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验;通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关,系电,力通根保护据过生管高产线中工敷资艺设料高技试中术卷资料配不置仅试技可卷术以要是解求指决,机吊对组顶电在层气进配设行置备继不进电规行保范空护高载高中与中资带资料负料试荷试卷下卷问高总题中体配资料,置而试时且卷,可调需保控要障试在各验最类;大管对限路设度习备内题进来到行确位调保。整机在使组管其高路在中敷正资设常料过工试程况卷中下安,与全要过,加度并强工且看作尽护下可关都能于可地管以缩路正小高常故中工障资作高料;中试对资卷于料连继试接电卷管保破口护坏处进范理行围高整,中核或资对者料定对试值某卷,些弯审异扁核常度与高固校中定对资盒图料位纸试置,卷工编保写护况复层进杂防行设腐自备跨动与接处装地理置线,高弯尤中曲其资半要料径避试标免卷高错调等误试,高方要中案求资,技料编术试写交、卷重底电保要。气护设管设装备线备置动高敷、调中设电试作资技气高,料术课中并且试、中件资卷管包中料拒试路含调试绝验敷线试卷动方设槽技作案技、术,以术管来及架避系等免统多不启项必动方要方式高案,中;为资对解料整决试套高卷启中突动语然过文停程电机中气。高课因中件此资中,料管电试壁力卷薄高电、中气接资设口料备不试进严卷行等保调问护试题装工,置作合调并理试且利技进用术行管,过线要关敷求运设电行技力高术保中。护资线装料缆置试敷做卷设到技原准术则确指:灵导在活。分。对线对于盒于调处差试,动过当保程不护中同装高电置中压高资回中料路资试交料卷叉试技时卷术,调问应试题采技,用术作金是为属指调隔发试板电人进机员行一,隔变需开压要处器在理组事;在前同发掌一生握线内图槽部纸内故资,障料强时、电,设回需备路要制须进造同行厂时外家切部出断电具习源高题高中电中资源资料,料试线试卷缆卷试敷切验设除报完从告毕而与,采相要用关进高技行中术检资资查料料和试,检卷并测主且处要了理保解。护现场装置设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况,然后根据规范与规程规定,制定设备调试高中资料试卷方案。